Keasling 又一重磅研究！多达 30 个酶促反应和 56 次基因编辑，Nature：工程酵母生产长春碱前体

发布于： 2022-09-19 00:00

2022 年 8 月 31 日，在最新的 Nature 上在线发布了一项极其重磅的研究进展：研究人员使用高度工程化的酵母，微生物从头合成了抗癌药物长春碱的前体：文多灵（vindoline）和长春质碱（catharanthine）。

该项研究展示了一条非常非常长的生物合成途径：从酵母的天然代谢产物香叶基焦磷酸（geranyl pyrophosphate）和色氨酸（tryptophan）到文多灵和长春质碱，期间总共涉及到 30 个酶促反应步骤！这，也是目前从植物转移到微生物的最长的生物合成途径！

从头微生物合成文多灵和长春质碱（来源：Nature）

为了实现这一超长生物合成途径在酵母细胞当中的重构，研究人员总共在酵母细胞中创纪录地使用了多达 56 次的基因编辑，这其中便包括了：表达 34 个植物来源的异源基因，以及删除、敲低和过表达 10 个酵母基因。

而带来这项研究的，正是合成生物学产业化先驱、美国工程院院士 Jay D. Keasling，以及其领导的丹麦技术大学（DTU）诺和诺德基金会生物可持续性研究中心的研究人员。

“由于长春碱途径是最长的单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成途径之一，这项研究将工程酵母定位为一个可扩展的平台，其可用于产生 3000 多种天然 MIA 以及几乎无限数量的全新天然产物衍生物。” 在论文中，研究人员这样写道。

单萜吲哚生物碱（MIA），是一个多样化的复杂植物次生代谢产物家族，其家族的许多分子具有独特的药用特性，这其中就包括抗癌治疗药物长春碱（vinblastine）和长春新碱（vincristine），此二者的年市场规模超过了 10 亿欧元。

由于 MIA 难以化学合成，全球的长春碱供应链依赖于从长春花植物中低产率的提取和纯化得到前体 “文多灵” 和 “长春质碱”，之后，再将此二者前体通过简单的体外化学偶联和还原，最终形成工业规模的长春碱。据估计，通过植物提取法，生产 1g 长春碱大约需要消耗多达 500kg 的长春花干叶。

长春花

因此，由于植物中的低含量以及长春花的供应不足，自 2019 年到 2021 年，这些药品都处于持续短缺状态，而长春碱和长春新碱也是被美国食品和药物管理局（FDA）列为 2019-2020 年短缺的药物。

而合成生物学，在过往便已经被用来生产多种植物来源的天然产物和药物，如青蒿素、阿片类药物和大麻素等等。而在 2018 年的 Science 上，长春碱完整合成通路的揭示，则为人们利用合成生物技术对长春碱进行生产提供了可能。

酵母中长春碱前体生产的完整生物合成途径（来源：Nature）

通过上图，显而易见的是，这一长达 31 步合成的长春碱途径，是相当复杂的。在长春花植物中，这些参与反应的酶便至少分布在了 5 个区室中（细胞质、质体、内质网、细胞核和液泡），并且涉及到了不同组织和细胞类型之间的运输。

为了在酵母中重构长春碱途径，研究人员根据底物和产物的可用性，将长春碱途径分为 3 个模块（参见上图），分别为：生产中心中间体异胡豆苷的模块（蓝色），生产它勃宁（Tabersonine）和长春质碱的模块（黄色），以及生产文多灵的模块（红色）。

此外，在图中，研究人员还使用了红色叉号、红色箭头和绿色箭头表示，用以分别表示删除、敲低和过表达了某些酵母基因。而这些对于酵母基因的改动，也都是研究人员在对各个模块和整个通路优化的结果。

工程酵母从头合成文多灵和长春质碱（来源：Nature）

在研究过程中，研究人员将每个模块分别在酵母中表达，以单独测试和确认该部分途径的功能可行性。最终，整合进 3 个模块并优化后的酵母菌株，成功地利用葡萄糖和色氨酸生产得到了文多灵和长春质碱，产量分别为 2.32 μg*L-1 以及 26.6 μg*L-1。

这一结果证明了这一超长生物合成途径在酵母细胞当中的成功打通，其经过 56 次基因编辑，包括了来自植物的 34 个异源基因，以及 10 个酵母基因的缺失、敲低或过表达，用以优化生物合成途径中关键前体的产生和积累。

在此基础之上，更进一步的，研究人员还通过调整模块拷贝数来对于这一整条合成途径进行了探究，研究发现：该途径生产的主要瓶颈集中在黄色的它勃宁和长春质碱模块，同时，进一步增强文多灵模块的表达并不利于长春质碱的生产。

两个前体合成长春碱（来源：Nature）

最后，研究人员还利用工业生产长春碱的方法，来尝试将生产得到的两个前体进行反应，以生成长春碱。他们使用的是 Fe (III) 方法偶联，其首先在发酵液中将两个单体直接进行反应的尝试最终以失败告终，不过，在分别纯化前体之后所进行的反应取得了成功，研究人员检测到了 23.9 μg*L-1 的长春碱。

最后的最后，在论文的讨论部分，研究人员还针对此项研究进行了总结和展望，我们摘取总结如下：

我们证明了文多灵和长春质碱的从头生产，其中文多灵生产途径是在微生物细胞中重构的非常长的异源途径；
与长春碱的工业规模生产相一致，文多灵和长春质碱从发酵液中纯化后，能够化学偶联形成长春碱；
虽然我们无法直接在酵母中制造长春碱，但是我们的微生物过程模拟了基于植物的生产过程；
这项研究为复杂抗癌药物的微生物生产提供了证明，未来还可以对工程酵母进行进一步的代谢工程和生物过程优化；
在酵母细胞中文多灵和长春质碱的成功生产，证明了全新的 MIA 天然产物及其衍生物的发现、生产以及生物活性测试方法的成熟。

论文链接： https://allianceforscience.cornell.edu/blog/2021/10call-for-policies-to-support-synthetic-biology-and-other-innova

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